Pyrosequencing技术及其在DNA测序和SNP研究中的应用[创新技巧]

生物通特约作者：黄文晋博士 [摘要]Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，基于该技术的分析系统结合相应软件和试剂可以进行DNA序列分析，SNP分析和SNP频率确定。本文介绍了Pyrosequencing技术的原理和应用。 [关键词] Pyrosequencing DNA序列分析 SNP分析     DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。     在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。     Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论． 一、Pyrosequencing技术的原理
首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。     Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。     测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。     硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。以上过程见图1.	图1 Pyrosequencing技术的原理： 随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。
商品化的Pyrosequncing试剂盒通过以下几点来保证反应的有效进行:底物浓度已最佳化，高质量的三磷酸腺苷双磷酸酶保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入；ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目。     有必要指出的是:Pyrosequencing技术可以确定一个模板的20-30bp的序列。有的研究者经过改进而使该技术的读序长度增加一倍以上[1]。     为了增加信噪比，在Pyrosequencing技术中，用dATPαS取代dATP，因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效利用，也更有利于阅读富含T的区域，且dATPαS不是荧光素酶的底物。但dATPαS是两种异构体SpdATPαS和RpdATPαS的混合物，聚合酶只能利用SpdATPαS。因此，为了得到最佳反应效率，必需使反应体系中保持最佳浓度的SpdATPαS，但同时增加了相应浓度的无用的RpdATPαS。dATPαS被双磷酸酶降解后的产物是双磷酸酶的抑制剂，所以随着反应进行，被双磷酸酶降解的dATPαS的降解产物浓度越来越大，双磷酸酶的活性越来越低。这可能是Pyrosequencing技术测序长度很短（20-30bp）的主要原因之一。新的革新就在于在反应体系中只加入SpdATPαS，这样一来可以大大降低dATPαS降解产物的浓度，维持双磷酸酶较长时间的活性。目前这个革新可以使Pyrosequencing技术的测序长度增加最少一倍，达到50至上百bp。 二， Pyrosequencing技术在DNA测序和SNP研究中的应用:     Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，因此该技术的第一个应用是DNA序列分析，基于该技术的分析系统配合相应软件还可以进行基于DNA序列分析的已知SNP的分析和SNP频率确定。     Pyrosequencing技术对DNA片段的序列分析的读序长度有限，但这并不影响其在生命科学研究中的价值.我们知道，在很多场合中，我们对DNA序列分析的要求是读序越长越好，比如诸如人类基因组计划的工作，而在很多场合中，读序长度并不是主要指标，读序精确和能说明问题是主要指标，比如分子临床诊断领域，对细菌和其他病原微生物的分子诊断，只需对最能代表该微生物的DNA片段进行分析即可，最能代表该微生物的DNA片段往往也就十几到几十bp。可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金标准，其权威性比其他DNA分析方法如NORTHERN，基因芯片和定量RT-PCR技术更好。     SNP研究大致分为两个部分，一是SNP数据库的建立，二是SNP功能的研究。一种生物的所有SNP的数据库的建立是一件很大的工程，可以承担该工作的是那些具有大规模基因组测序能力的研究单位，而且数据库的建立很大程度上依赖Sanger法测序。但众所周知，如果不研究每个SNP的功能，数据库的建立即SNP的发现就没有多大意义。对已发现的SNP的功能的研究，有两个工作是必须的，一是SNP频率分析，一是SNP位点的碱基种类的证实.对于前者，Pyrosequencing是这样进行的:假设研究者手中有若干份来自不同个体的基因组DNA样品，要测这些不同样品的同一SNP的频率，那么研究者可以混合这些样本的基因组DNA，然后做一次PCR，进行一次测序，研究者就可以得到该SNP在这些样本中的频率.如果研究者已经有了各个样本的PCR产物，也可以将PCR产物混合后进行一次PYRO，就可以知道该SNP频率.已有的文献已经做过高达1126样本的PCR产物的混合来确定SNP的频率[2]。这种做法极大地减少了研究者的实验次数和实验消耗。一些其他研究也利用Pyrosequencing技术来确定SNP频率[3，4]。如果是SNP位点的碱基种类的证实，需要首先得到特定SNP所在DNA片段，即PCR产物，然后在SNP位点的上游和/或下游设计测序引物，这样通过对十几个bp序列测定来确定SNP位点的碱基种类及SNP位点上下游十几个碱基的序列.诸如四倍体马铃薯的一些SNP分析[5]和用于法医研究的线粒体DNA SNP分析[6]也是利用Pyrosequencing技术进行的。     下面我们以炭疽热和幽门螺旋杆菌的分子诊断来具体说明Pyrosequencing技术在DNA序列分析和SNP研究中的应用。     细菌鉴定有很多方法，如表型表达(phenotypic expression)， 生物化学技术等.如果考虑操作费时和技术复杂，目前很多对细菌鉴定的方法并非最佳化.诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经常要培养几周才能得到供生物化学分析，鉴定和株系/亚种分型(subtyping)的纯净培养物。通过传统的培养和生物化学分析方法对其检测和鉴定费时且费用大，影响医生给予患者最合适的治疗。因为如果不能对细菌进行快速精确的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素，因而引发无效治疗和细菌耐药性。     随着分子生物学的发展，对细菌的分子诊断技术正在成熟.DNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生物的不同亚种/株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的分型比传统方法更为准确。对DNA的分析方法也有很多，如定量PCR，杂交(包括基因芯片)和DNA序列分析等。而只有DNA序列分析是黄金标准.很显然，DNA包含的遗传信息存在于DNA的ATCG排列次序中，搞清ATCG排列次序对DNA分析来说就是终结指标。如对诸如16S rRNA和内源RNAse P (endoribonuclease P， RNase P)基因的序列分析可以判断很多不同种类细菌或同种细菌的不同亚种/株系。     土壤细菌Bacillus anthracis (B. anthracis)是引起炭疽热严重感染的病原细菌。从接触病原体到症状最初出现的感染发展过程一般为1到6天。如果确认受到B. anthracis攻击，利用抗生素或解毒剂可以防治其感染，因此快速鉴定病原微生物种类和其致病力状态具有很重要的意义。在接触病原体的起初24-48小时内摄入抗生素可以防治其传染.抗体检测的诊断方法可能比病情进展稍微滞后，而在这个时期的防治可能是失败的。     被称为Ba813的一段DNA序列是B. anthracis的一个特异染色体标记，是B. anthracis区别于与其紧密相关的其他土壤杆菌种的标志。 Ba813长度为277bp，在染色体上为单拷贝[7]. 16S rRNA基因的序列分析被用于细菌分型，但不能用来分析B. anthracis，因为B. anthracis与B. cereus具有一样的16S rRNA序列。     B. anthracis的致病菌株有两个质粒，pXO1含炭疽热毒素产生的基因( lef， cya， pag). pXO2编码包装和孢子形成所必须的产物[7]。目前，通过DNA杂交来检测这些特异致病因子是鉴定B. anthracis的主要手段[7，8]。然而由于缺少一个或两个质粒的非致病菌株可能来自致病菌株[8]，因此此方法即不完全可靠又不快速。其他费时的方法包括gamma phage sensitivity tests和carbohydrate profiles[7]。     本研究试图建立新的鉴定B. anthracis及其致病状态的方法，即利用Pyrosequencing技术分析PCR扩增的Ba813的20bp的序列来鉴定B. anthracis，并通过分析lef和位于pXO2的cap的基因序列来确定B. anthracis的致病状态。     提取B. anthracis的质粒和染色体DNA，设计三对引物，分别扩增Ba813中的129 bp， lef基因的177 bp， cap基因的127 bp。每对引物的其中一条用生物素标记。     采用偶连streptavidin的微珠(Streptavidin Sepharose™ HP， Amersham Biosciences AB， Sweden)和PSQ™ 96 Sample Preparation Kit (Pyrosequencing AB) 及其相关方法将PCR双链分离，转移至PSQ 96 SQA Plate的含生物素引物的单链PCR产物和测序引物退火。     利用测序试剂盒SQA Reagent Kits (Pyrosequencing AB)和PSQ 96 DNA分析系统进行序列分析，结果用SQA软件进行分析。     通过对来自Swedish Defence Research Agency的13个B. anthracis分离物的Ba813的20bp片段的序列分析，其中12个分离物被明确鉴定为B. anthracis (Table 1)，另外一个由于PCR的失败而被排除.同时也检测了质粒(Table 1). SQA软件精确分析了11个分离物的核苷酸序列(大于等于20bp).其中一个序列的AA被错读为AAA，但这并不影响对细菌的鉴定.菌株鉴定的序列分析的精确度为99.6% (Table 2)，而致病力鉴定的序列分析的精确度为100% (Table 2)。     因此，利用PCR和Pyrosequencing技术的序列分析提供了一个可靠的鉴定Bacillus anthracis及其致病力的快速简单的方法。与其他方法相比，此方法速度快，几个小时出结果，而且结果精确。     幽门螺旋杆菌与胃炎，胃溃疡和胃癌都相关，对该细菌的分子诊断有三个方面。一是确定待检病原体是否为幽门螺旋杆菌.通过分析待检样品是否含GCGCAATCAGCGTCAGT就可以解决该问题，这段序列是幽门螺旋杆菌16S rRNA基因中的一段，是幽门螺旋杆菌区别于相关细菌的重要标志[9，10]。幽门螺旋杆菌分子诊断的第二个内容是幽门螺旋杆菌是否具有耐药性.23S rRNA基因的两个碱基的变异(A2142G和A2143G)与该细菌对抗生素Clarithromycin的耐受相关[11].第三个分子诊断内容是评估感染该细菌的个体发展为胃癌的可能性，是通过分析IL-1B基因的三个SNP (-511C/T，-31C/T，+3954C/T)[12]。更详细的资料请参考以下文章： Pyrosequencing技术在分子诊断方面的应用举例 参考文献 [1] Gharizadeh B， Nordstrom T， Ahmadian A et al， Long-read pyrosequencing using pure 2’-deoxyadenosine-5’-O’-(1-thiotriphosphate) Sp-isomer. Anal Biochem. 2002， 301(1):82-90. [2] Nordfors L， Jansson M， Sandberg G et al， Large-scale genotyping of single nucleotide polymorphisms by Pyrosequencingtrade mark and validation against the 5’nuclease (Taqman((R))) assay. Hum Mutat. 2002， 19(4):395-401. 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Principle of Pyrosequencing and its application is described in this article. [Key words] Pyrosequencing DNA sequencing SNP analysis